1941年4月5日，李先念率全师将领在随南通电就职。国民党调8.8万兵力向边区清剿，日顽呼应，加紧掠夺，边区抗日政府的财政经济发生空前困难。
陈少敏一方面组织地方武装和民兵配合新四军主力粉碎国民党第二次反共高潮和日寇扫荡，一方面召开财政经济会议，采取一系列措施，解决财政困难。成立财经委员会，她亲自担任财委书记。陈少敏与财政处长刘子厚、副处长丁冬放和军队供应部负责人研究，成立了边区工商局、粮食局、税务局、贸易局、银行，并深入开展减租减息运动。
陈少敏主持召开边区各县县长参加的财经会议，贯彻中央提出的自力更生方针。1941年边区遇到60年不遇的大旱，“人无米下锅，牛无草进栏”，部队实行“扁担饭”（日两餐）、“秤砣饭”（日一餐）。陈少敏两腿浮肿，亲见随南开明地主孙志阶，要他带头，富户借粮。在洛阳店村小学召开各界人士大会，100多人与会，陈少敏宣布：出借者政府出借条，秋后还粮加息，卖粮者政府当场付钱。当场借粮330石。
同时，陈少敏动员军民齐动手，开展生产自救。老少上阵，人尽其能，物尽其用。男人砍柴、烧炭、烧石灰、做扁担、打木器、编条筐、打猎、榨油、采山货、采药材、捕鱼；女人纺纱、织布、磨豆腐、养牛养羊、喂鸡喂鸭。
陈少敏在生产自救中以身作则，开了三分地种菜，分送百姓，出钱与农民合伙喂养一群鸭子，买了一辆纺车，夜晚和妇女一起纺纱。
陈少敏始终根据毛泽东“没有根据地、游击战争是不能够长期生存和发展的”思想和中原局“不建立抗日政权，单靠军事行动是难以立足的”指示精神，始终在不断发展武装，开展游击战争的同时，致力于根据地的扩大和民主政权建设。1941年4月，陈少敏主持召开边区第二次军政代表大会，成立边区行政公署。
1942年3月1日，边区首届人民代表大会胜利召开，陈少敏为大会主席。出席代表156人，其中共产党员47人，党外人士79人，台湾代表1人，日本反战同盟代表1人，临时代表10人，特邀代表18人。各地地委及行政干部、绅士列席25人。77岁的姚文轩穿过敌人7道封锁线来参会，参加过辛亥革命的潘怡如因病随身带着注射器来参会。会议历时20多天，日伪扫荡4次，会议地址转移4次。会议选举陈少敏为驻会委员会主席，许子威为行政公署主任。
1942年春，陈少敏领导边区整风学习，主持边区机关高干整风学习班，任班主任。
1942年9月，陈少敏主持召开边区第四次组织工作会议，在会上作了《在斗争中建设党》的讲话。
1943年1月，在大悟山蒋家楼子召开边区党委扩大会议，宣布中共中央关于实行党政军一元化领导的指示，并由李先念任边区党委书记、五师政委，陈少敏任副书记，负责地方工作。
1943年3月，蒋介石发表《中国之命运》，5月15日，共产国际解散，6月18日，胡宗南在洛川召开反共军事会议，部署“闪击延安”，掀起第三次反共高潮。第五战区司令长官李宗仁电令属部暂停对日作战，调10万兵力进攻豫皖边区。边区与五师处于危急时刻，战事不断，部队减员，根据地失陷，财政陷入极度困难。
陈少敏号召边区党政军民“咬紧牙关，熬过困难”。她主持边区党委会，作出《关于猛烈开展群众战争动员的指示》，要求每保有一游击小组、一自卫队、一少年先锋队，全民武装，陷敌于人民战争汪洋大海中。五师主力与地方部队、民兵互相配合，浴血奋战，历时一年，粉碎了国民党第三次反共高潮和日伪军多次、连续扫荡。1943年11月，中共中央华中局代表郑位三到达鄂豫皖边区。
1944年2月，在大悟山白果树湾召开边区党委扩大会议。
1944年2月17日，陈少敏亲自到礼南县安来乡搞试点。她组织医护人员先为群众防治脑炎，亲自教群众采药熬药，发现乡长问题后，亲自兼任乡长，全乡14保的农救会全部整顿建立起来。1944年3月12日，召开全乡代表大会，陈少敏在会上总结了安来乡整顿农救会的5条经验。
1944年6月23日，刘少奇、陈毅来电，指示五师北上，占领河南，使我华中、华北、陕北连成一气。
1944年7月1日，边区党委召开扩大会议，李先念、陈少敏提出从三个主力旅中派出两个旅去河南，未能通过。
1944年7月10日，中央和华中局先后电示五师“向北发展”、“不可错过”、“有极大意义”。在李先念、陈少敏坚持下，五师陆续抽出河南籍干部战士1000余人，组成豫南游击兵团，黄林任指挥，进军河南。只半年时间，开辟了纵横200里、7个县的抗日民主政权。
边区由于执行（白果树湾扩大会议）“以巩固为中心”的方针，没有派出主力向河南发展，丧失大面积占领河南的有利时机，未能使中原与华北解放区连成一片。这次战略性失误，使鄂豫边区孤悬敌后，给以后斗争造成极大困难，在解放战争中不得不突围而造成重大损失。陈少敏回想起来仍深感内疚。
1944年11月，在边区第一次农救会代表大会上，陈少敏代表边区党委作《一年来农救工作总结》的报告，并当选为边区农救总会主席。
1945年10月