1894年，光绪甲午二十年蔡元培27岁时，春应散馆试，得授职翰林院编修。 就在这一年，甲午战争爆发，开始接触西学，同情维新。1898年九月返绍兴，任绍兴中西学堂监督，提倡新学。

1900年，庚子二十六年蔡元培33岁，由于他的妻子受封建思想约束，他们之间的感情一直处在不和状态，而当他逐渐接受了西方新思想后，便开始重新思考女权的定义，于是写出了《夫妻公约》，重新调整与妻子王昭的关系。

1901年夏，辛丑二十七年，蔡元培34岁时，到上海代理澄衷学堂（现上海市澄衷高级中学）校长，即为首任校长。1901年9月，被聘为南洋公学经济特科班总教习。1902年1月1日，壬寅二十八年，蔡元培在杭州与他往日的学生黄仲玉女士举办了他一生中的第二次婚礼。

1902年，蔡元培35岁时，同蒋智由等在上海创办中国教育会并任会长，创立爱国学社、爱国女学，均曾被推为总理。1903年，癸卯二十九年，爱国学社的活动引起清政府的警觉，下令侦讯。蔡元培辗转青岛、日本、绍兴、上海等地，一方面学习德语，准备赴德留学以躲避风头，一方面仍从事教育和革命活动。

1903年，蔡元培为抗拒俄国政府觊觎中国北方领土，与上海反清革命志士以对俄同志会的名义办了《俄事警闻》（后改《警钟日报》）。1904年，甲辰三十年37岁时，他在上海组织建立了光复会。

1905年，乙巳三十一年38岁时，同盟会成立，光复会并入，孙中山委任蔡元培为同盟会上海分会负责人。